Identificação de cultivares de batata através de marcadores moleculares

Gláucia Salles Cortopassi Buso Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia buso@cenargen.embrapa.br – CP 02372 – CEP 70770-900 – Brasília, DF José Amauri Buso – Embrapa Hortaliças buso@cnph.embrapa.br  – CP 218 – CEP 70338-970 – Brasília, DF

A correta identificação de uma cultivar de batata é importante para o produtor, tanto de batata-semente como de consumo, para o processador, e brevemente também para o consumidor final. As cultivares de batata diferem umas das outras em vários aspectos e é comum serem identificadas visualmente por um conjunto de características da planta e do tubérculo.

Geralmente, a identificação comercial e legal de uma cultivar é feita comparando-se características morfológicas básicas peculiares a cada uma, especificadas pela autoridade aplicadora da Lei de Proteção de Cultivares no país (Serviço Nacional de Proteção de Cultivares, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento- MAPA). São aqueles conhecidos por conjunto mínimo de descritores de cultivares, suficientes para diferenciar uma nova cultivar das demais cultivares conhecidas. No entanto, algumas características morfológicas podem ser mudadas pela influência do ambiente, e dependem também da capacitação do especialista em fazer a aplicação dos descritores utilizados na caracterização.
Tecnologia recente tem provido meios de identificar cultivares pelo respectivo “fingerprinting” (correspondente à impressão digital) genético das mesmas.

Desde que algumas características avaliadas visualmente podem ser mudadas pelo ambiente, e dependem também da habilidade e treinamento do técnico descritor, as novas técnicas de identificação utilizando tecnologias moleculares são extremamente importantes na identificação de cultivares. Legalmente, se a característica molecular for herdada geneticamente e passível de utilização na identificação de uma cultivar, a característica molecular é também um descritor.

Todas as plantas têm DNA (ácido desoxirribonucléico), componente básico dos cromossomos e dos genes das células vegetais e animais, e responsável pela transmissão de características entre gerações subsequentes. Cada cultivar, presumivelmente, (exceto no caso de clones) tem seu DNA único, que é como uma “marca registrada” ou a “impressão digital” da mesma. Procedimentos relativamente novos de laboratório em biologia molecular têm expandido as opções na identificação de cultivares de batata. Os marcadores moleculares são marcas que identificam diferenças entre indivíduos ao nível molecular e a utilização dos mesmos tem possibilitado a identificação de clones, linhagens, híbridos, cultivares, estimativas de diversidade genética e elaboração de mapas genéticos. Técnicas de biologia molecular utilizadas para se obter marcadores moleculares têm expandido as opções na identificação de cultivares de batata. As técnicas são similares às utilizadas em humanos para identificar o padrão único dos indivíduos e mesmo a identificação de genitores desse indivíduo.

As técnicas mais utilizadas hoje em dia envolvem dois pontos chaves. O primeiro ponto é a escolha da região do genoma (isto Identificação de cultivares de batata através de marcadores moleculares é, conteúdo total de DNA) a qual será estudada e que terá maior probabilidade de revelar diferenças entre indivíduos e o segundo ponto é a necessidade de se amplificar seletivamente o DNA desta parte do genoma para que o mesmo possa ser visualizado facilmente, mesmo que se tenha pouco material para a análise. Para se amplificar somente a parte do genoma escolhida para se analisar, utiliza-se um processo chamado de PCR (“Polymerase Chain Reaction”) ou reação de polimerase em cadeia. Através do aumento e diminuição de temperatura repetidamente, edição de uma enzima (Taq polimerase) e iniciadores (“primers”), o DNA é amplificado em ritmo exponencial. Esta reação é feita em máquinas chamadas de termocicladores.

Para batata, algumas técnicas já foram testadas como: RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA”) ou polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (Fig. 1), AFLP (“Amplified Fragment Length Polimorfism”)
(Fig. 2) ou polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados, SSR (“Simple S e q u e n c e R e p e a t s ” ) (Fig. 3) ou s e q u ê n c i a s simples repetidas ou microsatélites. As duas primeiras técnicas amplificam regiões ao acaso do DNA, enquanto a terceira amplifica regiões repetitivas do genoma que, geralmente, não codificam nenhum gene, portanto com chances de serem diferentes entre indivíduos.
A reação de PCR é utilizada para amplificar estas regiões do genoma em vários indivíduos, o que vai produzir vários fragmentos de DNA de diferentes tamanhos. Estes fragmentos são separados em gel aplicado a uma corrente elétrica, pois os mesmos são atraídos por um terminal elétrico positivo.
Os fragmentos mais curtos se moverão mais facilmente do que os maiores, e ficarão em posição diferente dos fragmentos maiores num determinado período de tempo. O conjunto de fragmentos para cada indivíduo é corado para ser visualizado e fotografado, podendo ser comparado aos padrões obtidos para outros indivíduos.

Os três tipos de marcadores, citados acima, foram utilizados e conseguiram discriminar 16 cultivares de batata, utilizadas no estudo de Milbourne et al. (1997) e, mais recentemente, 39 cultivares, no estudo de
McGregor et al. (2000). No entanto, deve-se considerar características de cada técnica para se escolher o tipo de marcador que se deve utilizar. Uma delas é de ordem financeira, e RAPD é a menos onerosa das três. Outra consideração é a facilidade de utilização, e RAPD também é a que apresenta menos dificuldade pois não depende de desenvolvimentos anteriores e não utiliza radioatividade na detecção dos arcadores.
Por outro lado, SSR é o tipo de marcador mais informativo.

 
Figura 1. Exemplo de gel de RAPD Figura

2. Exemplo de gel de AFLP (cortesia da Dra. Ana Y. Ciampi)

 
Figura 3. Exemplo de gel de SSR

Gláucia Salles Cortopassi Buso Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia buso@cenargen.embrapa.br
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CP 218 – CEP 70338-970 – Brasília, DF A utilização de todas as técnicas disponíveis, hoje em dia, tem vantagens e desvantagens para cada tipo de análise. No entanto, os resultados com qualquer técnica baseada em DNA é mais conclusiva do que apenas as características morfológicas utilizadas normalmente na identificação de cultivares de batata. Como foi dito acima, características morfológicas podem ser afetadas pelo ambiente enquanto os procedimentos baseados em marcadores moleculares não o são. No entanto, a análise com marcadores moleculares não deve ser utilizada excluindo-se a caracterização morfológica. O valor dos resultados obtidos com marcadores moleculares está na análise combinada com as características morfológicas.

O Brasil hoje detém as técnicas moleculares adequadas para utilização na caracterização de cultivares de batata, bem como análise de homogeneidade e identidade de matrizes de programas de multiplicação, usando-se cultivo de tecidos.

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