Raças do vírus Y da batata (PVY) e a questão da variante NTN

Eng. Agr. José Alberto Caram de Souza-Dias (Ph.D) Pesquisador Científico do Instituto Agronômico de Campinas (IAC) – Centro de Fitossanidade / Virologia e-mail: jcaram@cec.iac.br Cx.P. 28; 13020-902; Campinas, SP (fone: 0xx19-32415188, ramal 360)

Assim como acontece no reino animal e vegetal, a diversidade genética, que resulta na ocorrência de raças entre indivíduos de uma mesma espécie, também ocorre entre microorganismos causadores de moléstias em plantas. Os vírus não são exceção à regra e neste artigo enfocaremos esse aspecto biológico em relação ao vírus Y da batata, cujo nome científico é Potato Virus Y (PVY), sendo suas características morfológicas e epidemiológicas descritas na Família dos Potyvirus (Kitajima, et al. 1997; Zerbini & Zambolin, 1999). Nos últimos 6 a 7 anos, o PVY tem sido o principal problema virológico relacionado com a degenerescência da batata-semente no Brasil (Souza-Dias, Tristão e Miranda Fo., 1995; Figueira et al., 1996). O PVY vírus é causador da moléstia conhecida por “mosaico” devido as variações na tonalidade de verde entre as nervuras dos folíolos apicais. Esses sintomas podem se manifestar nas formas “leve”, “severa” ou “pinheirinho”, sendo que as perdas variam de 30 a 100% em função das raças. Tanto as variações de sintomas como de perdas podem estar associadas não só com variedades de batata mas também com raças do PVY.

A nível mundial, é conhecida pelo menos 3 raças bem distintas do PVY que infectam a cultura da batata: PVYO, PVYN e PVYC (Salazar, 1996; Beemster and de Bokx, 1987; Banttari et al, 1993). Pode ainda haver variantes dentro desses grupos, como por exemplo uma variante do PVYN que se denomina: PVYNTN (Jeffries, 1998). Conforme veremos a seguir, cada uma dessas raças (ou variantes genéticas) do PVY apresentam características peculiares quanto a expressão de sintomas, distribuição geográfica e técnicas para identificação.

PVYO
A raça PVYO encontra-se disseminada no mundo todo e é a predominante na América do Norte (Banttari et al., 1993). É causadora de necrose em forma de riscas nas nervuras secundárias (face inferior do folíolo) com formato de anéis necróticos de cor marrom escuro, mais comum na parte apical da planta. A intensidade das necroses é geralmente maior nos casos de infecção primária, isto é, durante a estação corrente.

Figura 1. Folhas apicais de plantas de batata var. Itararé apresentando folíolos enrugados e com curvatura acentuada para baixo. As riscas necróticas nas nervuras são típicas da infeção pelo PVYO que neste caso é primária.

Além dos sintomas de mosaico, as plantas de batata originadas de tubérculos (batatas- sementes) infectados pelo PVYO podem apresentar ainda aspecto de “pinheirinho” devido a necrose de pecíolos e queda das folhas mais velhas. Pode-se observar também nessa virose, folhas ressecadas e dependuradas na parte mediana das hastes (Figura 1). Esses sintomas podem ser vistos tanto na infecção primária precoce como na secundária, quando o vírus é perpetuado pela batata-semente (Figura 2).

A raça PVYO pode ser identificada através da inoculação pelo inseto vetor ou fricção mecânica em plantas-testes de fumo (Nicotiana tabacum L. cv. Turkish), nas quais causa apenas clareamento das nervuras e avança para mosaico leve sob condições de temperaturas amenas. Sob condições de dias mais quentes pode-se observar apenas leve clorose em comparação com controles sadios, mas os sinais de necrose nas nervuras permanecem visíveis, principalmente na face inferior dos limbo foliar. Essa resposta das plantas testes de fumo para com a raça PVYO é importante na diferenciação biológica com uma outra raça, denominada PVYN.

PVYN
O PVYN , ao contrário da agressividade dos sintomas expressos pelo PVYO, essa raça manifesta geralmente mosaico leve em plantas de batata. Folíolos apicais de plantas de batata de diferentes variedades não apresentam riscas necroticas nas nervuras, apenas variações de amarelo internerval e ondulação do limbo foliar (Figura 3 A, B ). Entretanto, essa afirmativa de ausência de necrose nas nervuras nos folíolos pode não ser definitiva, para as raças PVYN ,principalmente pelo fato de se tratar de espécies de vírus pertencente à família dos Potyvirus, a qual apresenta ampla gama de diversidade genética. Além disso, quando se trata de infecção primária por raças variantes do próprio grupo N , como veremos a seguir, com a raça PVY NTN é possível que haja alguma necrose de nervura ou riscas pardas em com formação anelar, semelhante ao PVY O , tornando discutível a afirmação de espécie de PVY apenas no reconhecimento visual.

É sempre importante e necessário ressaltar sempre que a letra N seguida ao nome do vírus causa geralmente confusão pois esta se refere à palavra “Necrose”, mas não em plantas de batata (o que é raro conforme dito acima). Esse N é sim referente à necreose das nervuras em espécies de plantas-testes de fumo (N. tabacum L. cvs. Turkish ou principalmente a cvs White Burley). A raça PVYN é mais predominante na Europa e inclusive Russia, bem como partes da Africa e América do Sul (de Bokx, 1981). No Brasil, foi detectada em lotes de batata-semente oriundos da Argentina (Souza- Dias, et al, 1992). Foi também detectada na América do Norte, mais precisamente no Canadá, em um surto ocorrido no início da década de 90. É possível entretanto, que a origem de isolados do PVY N identificado no Canadá seja européia (Lacy, 1997) .

Independente de onde possa ter originado o PVYN na América do Norte, é interessante observar que não se tem mais registrado nenhuma ocorrência em seus principais países produtores (Laferriere, 1999; Tompson, 2001), após mais de 6 anos de intensivas análises serológicas (ELISA com antissoro monoclonais) e biológicas (testes com plantas-testes de fumo). Esse fato é sugestivo do desaparecimento da raça PVYN tanto nos batatais dos EUA como nos do Canadá, que pode ter ocorrido em função de rígido e eficiente trabalho de erradicação (Banttari et al;. 1993; Mc Donald & Singh, 1996), efetuados nesses dois países. O ênfase que esse fato merece é devido ser o Canadá o país que nos últmos anos tem exportado as maiores quantidades de batata-semente para o Brasil, sendo a variedade Atlantic a única importada daquele país (ANABA, 2001), e justamente uma variedade de alta suscetibilidade ao PVY.

PVYC
O PVYC ocorre com mais frequência na Austrália e algumas regiões da Europa (de Bokx, 1981), Equador (Fernandez- Northcote, 1990), América do Norte (Ellis et al. 1997), Ã frica do Sul e Nova Zelandia (Jeffries, 1998). A raça PVYC não tem sido identificada nas plantações comerciais do Brasil, conforme observado em estudos recentes (Daniels, 2000). É portanto, bastante provável que essa raça esteja ausente no território brasileiro.

Figura 2. Planta à esquerda: Sintoma secundário de mosaico do tipo “pinheirinho”, devido a infecção com o PVYO perpetuado pela batata-semente (tubérculo-mãe). Planta à direita: Sintoma primário de mosaico, também do tipo “pinheirinho” mas em apenas uma das hastes originadas de uma mesma batata-semente. Essa planta exemplifica à infecção precoce durante a estação corrente.

PVY NTN
O PVY NTN, é uma raça variante do PVYN . Com o aumento da disseminação das raças N e O, conforme verificado nos últimos 6-7 anos nas principais regiões produtoras do Brasil, existe uma constante e desastrosa ameaça da introdução dessa nova e agressiva raça do PVY associada à batata- semente importada de países onde ela esteja ou tenha estado presente. Como podemos observar mais adiante, a distribuição geográfica do PVY NTN já é bastante abrangente.

Sintomas do PVYNTN
Além de mosaico bastante evidente, com folíolos apicais ondulados e de tamanho menor que os de plantas sadias, são sintomas típicos do PVYNTN as necroses superficiais que aparecem nos tubérculos das variedades mais suscetíveis: ex. cultivares Monalisa, Atlantic, Vivaldi etc. Essas necroses adquirem formas de círculos, ou desenhos do tipo meia lua, com formato de números, como 8, 6, 9, 3; ou letras, como C, O, S (Figura 4 A e B ) . A presença dos anéis necróticos na superfície dos tubérculos é uma das identificações biológicas mais evidentes e aceita como indicativa para a raça PVYNTN. Ressalta-se entretanto, que os sintomas de anéis nos tubérculos são tão marcantes e depreciativos que os tornam inviáveis para o mercado. É justamente devido aos sintomas de anéis que essa raça do vírus Y foi denominada PVYNTN (Jeffres, 1998). Isto porque o primeiro N do NTN identifica a raça como pertencente ao grupo do PVYN; as letras seguintes: TN indicam “necrose nos tubérculos” (que na lingua Inglêsa se escreve “Tuber Necroses”).

Figura 3 A. Plantas à esquerda: Sintomas de mosaico severo, manifestando amarelo internerval e ondulações nas margens dos folíolos apicais. Planta à direita: Sintoma de mosaico leve, difíceis de serem identificados visualmente durante as horas mais quentes ou ensolaradas. Esses sintomas são devido à infecção primária ou secundária pelo PVY N e geralmente não apresentam sinais de necrose nas nervuras ou pecíolos.

Figura 3 B. Planta à esquerda: Sintomas de mosaico leve/severo devido à infecção com o PVYN , com ondulações ou enrugamento do limbo foliar. Notar variações nas tonalidades de verde; menos intensas que na Figura 3 A (acima). Planta à direita: Normal.

Na fase inicial dos sintomas, os círculos são salientes na epiderme do tubérculo (extremidade apical) sugerindo um arranhão superficial, seguido de erupção da epiderme. Esses primeiros sinais são semelhantes a um inchaço de coloração ligeiramente rosa e progridem para ranhuras como se fosse devido a pressão das unhas. A medida em que acentuam os desenhos necróticos, a coloração das lesões torna-se parda (Figura 4 B). Pode ocorre também escamações e rompimento da epiderme no centro das lesões. Os anéis necróticos podem estar isolados ou unidos, adquirindo formas que sugerem as letras S, C, U ou números 8, 9, 6, 3 ou 0. Manifestam-se nos tubérculos por ocasião da colheita ou logo após, durante o armazenamento. É importante observar que os anéis necróticos são sempre a nível de epiderme e portanto superfícial, não se aprofundando nos interior dos tubérculos (Figura 4 A). O fato de ficar apenas uperficial os sintomas do PVY NTN permite diferenciar essa virose de outras que também causam sintomas de necrose, evidente na superfície e também dentro dos tubérculos, tais como: Tobacco Ratle Virus (TRV) ou Potato Mop-Top Virus (PMTV) (Beemster and de Bokx, 1987).

Tubérculos com os sintomas de necrose causada pelo PVYNTN, são geralmente identificados nas esteiras de classificação e rejeitados, indo para descarte. Entretanto, isolados da raças PVYNTN foram estudados no Canadá sob condições de estufa, originados de tubérculos para consumo (“tablestock”) importados da Califórnia (EUA). Esses tubérculos eram tanto de pele avermelhada como de pele branca (McDonald & Singh, 1993; McDonald & Singh, 1996). A aparência dos sintomas nos tuberculos, de diferentes variedades é bastante depreciativa.

Na variedade Monalisa, que hoje ocupa mais de 60% das áreas de batata no Brasil, as lesões causadas pelo PVYNTN nos tubérculos chegam a ocupar mais da metade da superfície (Figura 4 B). É interessante porém, ressaltar que a Monalisa é uma variedade que apresenta alto nível de resistência às raças comuns do vírus Y (PVYO e PVYN ), mas torna-se altamente suscetível e sensível ao PVYNTN. O mercado para processamento e consumo in natura no Brasil tem nas variedades Atlantic e Bintje seu padrão de qualidade, respectivamente. Essas duas variedades porém, apresentam alta suscetibilidade às raças comuns do PVY; comportam-se também como suscetíveis à infecção pela raça PVYNTN. Mas, quanto à manifestação das necroses na superfície dos tubérculos, a Atlantic apresenta-se moderadamente sensível (McDonald & Singh, 1996) enquanto Bintje é insensível, isto é, não mostra sintomas nos tubérculos apesar de infectada (Bus, 1996). Na folhagem porém, os sintomas de mosaico podem ser iguais ou mais severos que os causados pelo PVYN. Há evidências que sugerem a possibilidade de que quanto maior a resistência da variedade ao PVY O ou N, maior a sensitividade para com a expressão dos sintomas de anéis necróticos superficiais nos tubérculos, causados pelo PVYNTN (McDonald & Singh, 1996).

Distribuição geográfica do PVYNTN
O PVYNTN foi primeiramente descrito na Hungria em 1984 (Beczner et al;. 1984.) e desde então, em outros países da Europa (Alemanha, Dinamarca, França, Bélgica, Austria, e Iugoslávia) e Oriente Médio, particularmente no Libano, onde também se registrou a presença dessa nova raça (Le Romancer et al. 1994.). Na Holanda, foram efetuadas avaliações da população de Potyvirus local (Van Den Heuvel, et al;. 1994) e até o presente não há evidências da presença dessa raça, estando a Holanda oficialmente livre da raça PVYNTN ( Van Den Heuvel, 1999, comunicação pessoal).

Um dos países que teve maior prejuízo com o PVYNTN foi a Slovenia, onde, em apenas três anos (1988-1991), ocorreu a paralisação comercial da cultivar Igor. Essa variedade era uma das mais cultivadas naquele País e ocupava quase 60% (18 mil ha) das áreas cultivadas com batata (Kus, M. 1995, citado por McDonald & Singh, 1996).

Apesar de não haver registro da presença do PVYNTN em campos de produção comercial tanto no Canadá como nos EUA, um surto da raça N (PVYN) ocorrido nos primeiros anos da década de 1990, em regiões produtoras do Canadá (Singh, 1992; McDonald & Kristjansson. 1993) foi suficiente para promover ações de testagens específicamente para a raça N do PVY. Certamente este foi um exemplo da atuação rápida que as víroses emergentes, particularmente as da família dos Potyvirus exigem. Ações efetivas como essa, que envolveram além de aspectos técnicos também diplomáticos (Murray, 1996), permitiram evitar potenciais prejuízos de restrições no segmento da batata-semente.

Enquanto há relatos de que o PVYNTN já atinge níveis epidêmicos em alguns países do leste da Europa, Israel e Libano (EPPO, 1997), em outros porém, como possívelmente seria o caso dos EUA e Canadá, essa raça pode ter se desaparecido, naturalmente ou em função de eficientes trabalhos de erradicação.

O perigo da introdução do PVYNTN no Brasil e suas consequências
No Brasil, um primeiro  alerta para o perigo da introdução dessa nova raça do PVY (PVY NTN) em tubérculos (batata-semente) importados foi publicado em 1996 (Souza-Dias, 1996). Nesse alerta chamouse a atenção para a variedade Atlantic, devido a alta incidência de vírus Y que estava sendo constatado em campos plantados com batata-semente importada (“de caixa”), ou seja, de primeira geração no Brasil (Souza- Dias, 1995; Souza-Dias & Tristão, 1997).

Além dos danos cosméticos que o PVYNTN causa nos tubérculos de diferentes variedades, a sua agressividade tem sido também registrada através da capacidade de quebrar resistência de praticamente todos os genótipos de batata conhecidos como resistentes ao PVYN (van den Heuvel et a;. 1994).

A transmissão do PVY em geral é feita na natureza através de diferentes espécies de pulgões (afídeos), os quais estão presentes em maior ou menor população mas durante o ano inteiro no Brasil. Além disso, o PVY mantem apenas relação com o aparelho bocal (estilete) dos insetos, significando que são capazes tanto de adquiri-lo como de transmiti-lo em questão de segundos, ou seja, durante as rápidas picadas de prova na planta (Peters, 1987). Portanto, ao contrário do que ocorre com outros vírus da batata, como o “Potato Leafroll Virus – PLRV” causador do enrolamento da folha da batata (Souza-Dias e Iamauti, 1997), os pulgões transmissores (vetores) do PVY, não precisam permanecer se alimentando por várias horas nas plantas de batata para proceder a aquisição ou transmissão. Fica portanto, quase impossível o controle da disseminação de raças do PVY se não for feito de forma integrada. O uso de inseticidas sistêmicos para controle dirigido aos pulgões vetores não é tão eficiente para controle do PVY com tem mostrado ser para o controle do PLRV (Boiteau and Singh, 1999). Esse fato encontra explicação nas diferenças da relação virus-vetor-hospedeira existentes entre PVY e PLRV (Souza- Dias e Iamauti, 1996).

Testes para identificação do PVYNTN
O PVYNTN não apresenta até o presente um teste biológico ou serológico (van den Heuvel, et al. 1994), indiscutível e confiável por si só, que permita distinção com outras raças do PVY. A distinção mais precisa pode ser feita apenas a nível de ácido nucleico, isto é, com testes moleculares do tipo RT-PCR (Glais, et al;. 1996; Singh et al; 1998; Cerovská, 1998; Weidemann and Maiss. 1996). Em síntese, ainda não é possível distinguir raças do PVY via análise de plantas-testes ou capa protéica (ELISA), mas sim e tão somente por análise de ácido nucleico viral, através de teste PCR (Jeffries, 1998).

Figura 4 A. Tubérculos da var. Monalisa apresentando sintomas de anéis necróticos típicos da resposta à infecção pela raça PVY NTN . As setas mostram que as lesões são superficiais apenas; não causando danos na parte interna dos tubérculos afetados.

Atualmente, os testes mais confiáveis para identificação de raças do PVY são os da reação em cadeia da enzima polimerase, (“Polimerase chain reaction – PCR) onde se utilizam primers degenerados (universais) específicos para o grupo PVYNTN (Jeffers, 1998). Para caracterizações mais detalhadas, o material amplificado do PCR poderá ser ainda sequenciado e ou submetido a cortes com enzima de restrição, RFLP (Glaiss et al;. 1996). Mais recentemente um novo conjunto de primers foi usados para PCR com 2 ou 3 primers podendo identificar precisamente 2 PVYNTN de 55 isolados do PVYN (Singh et al;. 1998).

No Instituto Agronômico de Campinas (IAC), as pesquisas para identificação das diferentes raças do PVY, em tubérculos ou folhas de batata, têm sido efetuadas com base em testes biológicos (Plantas-testes); sorológicos (TAS-ELISA) e moleculares (RT-PCR). Para os testes de PCR, o kit da empresa ADGEN Ltd (Scotland, UK) tem servido como referência. Esse kit tem sido recomendado pela sua alta eficiencia na diagnose seletiva do PVYNTN em comparação com as raças PVYO e PVYN. Entretanto, a confiabilidade de qualquer kit para diagnose da raça PVYNTN não pode nem deve ser apenas em função da confirmação do produto (RNA viral amplificado) de tamanho esperado no PCR mas, também na presença de sintomas típicos nos tubérculos (van den Heuvel, IPO, Wageningen, comunicação pessoal).

Figura 4 B. O tubérculo central apresenta sintomas iniciais da lesão causada pelo vírus PVYNTN . Notar a erupção (tipo inchaço) da epiderme. Esses sintomas, em poucos dias, avançam para necrose em forma de ranhuras circulares, de coloração parda.

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