Testes de Viroses da Batata no Centro de P&D Fitossanidade – APTA Instituto Agronômico de Campinas (IAC)

José Alberto Caram de Souza Dias (Eng. Agr. PhD) – Pesquisador Científico – Virologista APTA- Instituto Agronômico de Campinas (IAC) – Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Fitossanidade (CPDFitossanidade) Laboratório de Viroses da Batata e Solanáceas em Geral (LVBSG) – Av. Barão de Itapura 1481 (C. Postal 28) CEP: 13001-970 Campinas/ SP (Brasil) (19) 3241.5188 – cel. (19) 9256.1961
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Planta teste de Datura stramonium, inoculada com PLRV por enxertia.
Sintoma de amarelo interneval.

As pesquisas e serviços de diagnose de viroses da batata (Solanum tuberosum L.) têm uma longa tradição no IAC. Tiveram início na década de 1930, com o Dr. Ãlvaro Santos Costa, de saudosa memória. As técnicas de diagnose, ou tipo de testes, aplicados para a identificação de viroses em tecidos de folhas ou tubérculos de batata vêm acompanhando o estado-de-arte da ciência, mas continuam a conviver e serem aplicados de forma simultânea ou individual, dependendo do tipo de virose ou da investigação que se faz necessária. Os principais testes, mais comuns na diagnose de rotina de viroses da batata, em tecidos de folhas, tubérculos dormentes, brotos etc, são:

Testes Biológicos: Identificação de vírus baseada em sintomas de plantastestes, indicadoras, via transmissão mecânica, enxertia ou insetos vetores. Demanda espaço físico, mão-de-obra na produção de plantas e tempo (meses) para os resultados. Não são específicos e limitados com relação à sensibilidade. Geralmente aplicada quando não se conhece ou se suspeita de qual vírus (se é que seja vírus) estaria causando o sintoma em questão.

Microplacas do ELISA, teste PVY em tubérculo dormente (olho) à esquerda, amostra de campo consumo – à direita, com ausência do vírus – minitubérculos telado

Testes Imunológicos: Identificação específica de vírus, através da interação (captura) do antígeno (tipo de vírus) pelo anticorpo específico (imunoglobulina, IgG, obtido do soro do sangue de animal, geralmente coelhos, após injetado/ inoculado com solução purificada do vírus). Essa captura é específica, isto é, anticorpo contra o vírus do PLRV não interage com vírus PVY e vice-versa. O tipo de teste imunológico mais comum é o ELISA, em que uma enzima é acoplada a um anticorpo secundário. Os kits contendo anticorpos dos principais vírus da batata: PLRV, PVY, PVS, PVX, além de Tospovirus (vira-cabeça), Tobacco rattle vírus, Potato mop top vírus, Alfafa mosaico vírus, e vários outros, são adquiridos das principais empresas produtoras como EMBRAPA-CNPH; Bio- Rad (França), ADGEN (Escócia), AGDIA (EUA), IRI_Wageningen (Holanda), entre outros. A vantagem principal do ELISA é sua alta especificidade, sensibilidade e custo relativamente baixo, podendo ser executado em grande número de amostras (geralmente em nosso laboratório no IAC, testamos condições de testar até 200 tubérculos ou folhas por dia), com resultados em até 2 dias. Ao longo dos últimos 15 anos, já foram realizados cerca de 600 mil testes para atender produtores e trabalhos de pesquisa. Como desvantagens, observam-se casos de falso positivo (presença) ou falso negativo (ausência) para o vírus em teste. Julgar e evitar esses casos demanda experiência do laboratorista e modo de operação das amostras, bem como qualidade dos reagentes empregados.

Testes moleculares: Baseado na identificação de áreas específicas do genoma , ou seja, do código genético do vírus. O teste mais conhecido atualmente é o PCR, em que uma enzima denominada polimerase, após 30 a 40 ciclos de altas e baixas temperaturas, amplifica em muitos milhões de vezes uma determinada área do genoma do vírus para a qual foi produzida uma sonda (primer), codificada para reconhecer o genoma do vírus e dar início e fim à região amplificada. Dessa forma, o produto amplificado do genoma pode ser visto, isolado e sequenciado para comparação com genomas semelhantes em banco de germoplasma. Tratam-se de técnica muito maior sensitividade e especificidade do que o ELISA.
Entretanto, é mais cara e demanda equipamentos e estruturas laboratoriais mais complexas para suas análises. Tem sido, por isso, limitada para uso em casos de necessidade de confirmação de determinados vírus ou raças, como, por exemplo, a raça NTN do PVY (PVYNTN), ou outras raças do PVY, como a recentemente identificada na cv. Monalisa (região de Casa Branca- SP), denominada “encrespamento”.

PCR para PLRV. Primers UP3 e DP4. Colunas 1a 4 indica o PLRV (358 pares de base -pb amplificado de tubérculos); 5-7 sadios; 8 padrão 123 pbs.